Wnt信号通路在成骨细胞中的作用：成骨还是破骨？

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.33.021

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究表明，Wnt信号通路参与调节骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，促进成骨细胞增殖和分化，抑制成骨细胞的程序性死亡，间接影响破骨细胞的功能。
目的：分析Wnt/β-连环蛋白信号通路与骨疾病的关系。
方法：通过计算机检索CNKI和Elsevier数据库中2000年1月至2014年1月文献，关键词为“Wnt/β-连环蛋白、成骨细胞、骨髓间充质干细胞、骨质疏松，骨关节炎”。选择与Wnt/β-连环蛋白信号通路对成骨细胞及骨疾病影响有关的文章内容进行归纳分析。
结果与结论：Wnt信号通路包括Wnt/β-连环蛋白信号通路(Wnt经典信号通路)；Wnt/Ca2+信号通路；Wnt/PCP(平面细胞极性)信号通路等。Wnt信号途径是体内重要的信号调节系统之一，对成骨细胞、破骨细胞和软骨细胞的分化、增殖和程序性死亡过程中扮演重要角色。在类风湿关节炎患者体内Wnt信号途径主要通过成骨细胞发挥作用。其成骨细胞中Wnt信号途径的抑制因子上调，能够降低骨保护素/受体活化因子配体比值，促进破骨细胞分化成熟。研究Wnt通路的组分及其作用，不仅有助于骨疾病的特定治疗，而且有利于预防骨质疏松及其他关节性等疾病。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 骨组织工程, 骨质疏松, Wnt信号通路, 成骨细胞, β-连环蛋白

Abstract:

BACKGROUND: Wnt signal pathway is involved in the regulation of bone marrow mesenchymal stem cells differentiating into osteoblasts, promotes osteoblasts proliferation and differentiation, inhibits programmed death of osteoblasts, and indirectly affects the function of osteoclasts.
OBJECTIVE: To summarize the relationship between Wnt/β-catenin signal pathway and bone disease.
METHODS: A computer-based online search was performed to find papers published between January 2000 and January 2014 in CNKI database and Elsevier database. The key words were “Wnt/β-catenin, osteoblasts, bone marrow mesenchymal stem cells, osteoarthritis, chondrocytes” in Chinese. Documents concerning the effects of Wnt/β-catenin signal pathway on osteoblasts and bone disease were included.
RESULTS AND CONCLUSION: Wnt signaling pathway is consisted of Wnt/β-catenin signal pathway (Wnt typical signal pathway), Wnt/Ca2+ signal pathway and Wnt/planar cell polarity signal pathway. Wnt signaling pathway is one of the most important regulatory systems that plays a key role in modulating the differentiation, proliferation and programmed cell death of osteoblasts, osteoclasts and chondrocytes. The role of Wnt signal pathway in patients with rheumatoid arthritis is mediated by osteoblasts. The inhibitory factor of Wnt signal pathway in osteoblasts is upregulated, which reduces the ratio of osteoprotegerin/receptor activating factor ligand, promotes the osteoclasts differentiation and immaturation. The researches addressing the components and effect of Wnt signal pathway are important for the special treatment of bone diseases and the prevention of osteoporosis or other bone diseases.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: osteoporosis, WNT proteins, osteoblasts

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 1

2.1 Wnt信号通路 Wnts蛋白是一类参与胚胎发生，器官发生，形态发生等过程的分泌性糖蛋白家族，作为形态发生素通过激发细胞内远离信号发送区域的浓度依赖反应控制胚胎形态发育，由原癌基因Wnt编码，含有约350个氨基酸残基，通过自分泌或旁分泌发挥作用，由于小鼠Int-1原癌基因与果蝇Wingless基因同源，将两者名称合并即产生了其家族第1个成员——Wnt1。在人类目前已发现至少19种Wnts蛋白家族成员(包括Wnt3a，Wnt5a，Wnt5b，Wnt7b，Wnt10b等)^[1-4]。

除了果蝇的Wingless(Wg)Wnt3/5Wnt4等大分子蛋白外，所有的Wnt蛋白均具有相似的结构特点。大多数Wnt蛋白大小约40 kb，含有350个左右的氨基酸残基，其中有部分带电残基及23-25个在不同物质之间高度保守的半胱氨酸残基部分半胱氨酸残基形成分子内或分子间二硫键，参与Wnt的折叠及多聚化^[5-6]。Wnts蛋白与细胞膜上的Frizzled(卷曲蛋白)受体结合，引发不同的细胞内信号转导通路，Wnt信号通路调节的失常可引起多种病理变化。Wnt信号通路包括Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路(Wnt经典信号通路)；Wnt/Ca²⁺信号通路；Wnt/PCP(平面细胞极性)信号通路等^[7-9]。

Wnt/β-连环蛋白信号通路也被称为Wnt经典信号通路，该转导通路的基础是对胞质内β-连环蛋白的磷酸化和降解的调节。当缺乏Wnt蛋白时，Wnt通路未启动，β-连环蛋白与支架蛋白，肠腺瘤息肉蛋白，糖原合酶激酶3β (GSK-3β)形成降解复合物，促进了β-连环蛋白的磷酸化，导致β-连环蛋白降解；当Wnt蛋白与卷曲蛋白-(低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6)复合受体结合，Wnt信号通路启动，激活胞内的Dvl(蓬乱蛋白)，抑制糖原合酶激酶-3β的激活，使降解复合物失去活性，抑制了β-连环蛋白的磷酸化，β-连环蛋白在胞内累积，而后由胞浆进入胞核，与T细胞因子/淋巴增强因子转录因子家族成员结合，启动下游靶基因的转录和表达^[10-11]。

Wnt/Ca²⁺信号通路，Wnt/PCP(平面细胞极性)信号通路称为Wnt非经典信号通路。Wnt/Ca²⁺信号转导通路启动后，胞内Ca²⁺浓度升高，可激活磷脂酶C和蛋白激酶C，进而活化相关转录因子，但该通路在成骨方面少有相关研究：Wnt/PCP信号转导通路启动后，可激活JNK(c-Jun氨基末端激酶)及Rho相关激酶，使细胞结构重组，调节细胞骨架的不对称分布，及阶段性调控胚胎发育^[12-13]。相对于Wnt经典信号通路，非经典信号通路的研究还较少，许多作用机制的研究还有待进一步深入研究。

2.2 Wnt经典信号通路中的相关蛋白

2.2.1 卷曲蛋白(Frizzled) Frizzled蛋白，是存在于细胞表面的特异性受体，特点是含有7个跨膜片段，胞外N端具有富含半胱氨酸的结构能与Wnt蛋白结合^[14]，胞内与蓬乱蛋白作用，抑制β-连环蛋白的降解。在人类至少已发现10种卷曲蛋白受体。Wnt蛋白与受体的结合受到许多分泌性拮抗剂家族成员的调控，分泌性卷曲蛋白相关蛋白家族可通过与卷曲蛋白受体结合，竞争性抑制Wnt蛋白与卷曲蛋白受体的结合，从而抑制Wnt信号通路的转导^[15]。

2.2.2 低密度脂蛋白受体相关蛋白5/低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP5/LRP6) 低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6是低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)家族成员，是细胞表面跨膜受体蛋白，低密度脂蛋白受体相关蛋白5在进化过程中高度保守，有研究发现，人与小鼠低密度脂蛋白受体相关蛋白5的蛋白序列同源性高达95%^[16]。Wnt蛋白通过与卷曲蛋白受体与低密度脂蛋白受体相关蛋白5辅助受体结合，启动Wnt经典信号通路^[17]。

骨质疏松-假性神经胶质瘤综合征是一种常染色体隐性遗传病，患有此病的儿童常常因骨量偏低而导致骨折以及骨骼畸形。与其他影响骨骼的遗传病相比，骨质疏松-假性神经胶质瘤综合征的特点是不伴有胶原合成、软骨内成骨及破骨细胞为主的骨吸收方面的异常，体内钙离子平衡不受影响。此外，骨质疏松-假性神经胶质瘤综合征患者因眼部血管发育异常，在出生时以及出生后1年内出现视力受损现象。

1996年，Gong等^[18-19]应用连锁分析结合基因纯合性作图(homozygosity mapping)技术将骨质疏松-假性神经胶质瘤综合征致病基因定位于染色体11q12-13的3Mb区域内，证实该综合征不存在基因位点的杂合性。2001年，该研究小组进一步利用定位候选克隆的方法发现低密度脂蛋白受体相关蛋白5基因是骨质疏松-假性神经胶质瘤综合征致病基因候选区内惟一的一个已知基因。通过对骨质疏松-假性神经胶质瘤综合征患者进行低密度脂蛋白受体相关蛋白5基因突变分析，证实低密度脂蛋白受体相关蛋白5基因突变导致骨质疏松-假性神经胶质瘤综合征。他们还发现，携带突变基因的杂合子个体的骨密度显著低于正常对照组，表明低密度脂蛋白受体相关蛋白5影响骨量具有显性特征^[20]。

2.2.3 β-连环蛋白 β-连环蛋白是由CTNNB1基因编码的一类多功能蛋白，也是Wnt信号通路的枢纽因子，通过β-连环蛋白蛋白胞内累积进入核内，调节基因的转录和表达。β-连环蛋白结构中含3个重要结构域：N端末端、连接臂重复区、C末端，其中含150个氨基酸的N端末端是糖原合酶激酶-3β磷酸化的作用部位；连接臂重复区是多种配体T细胞因子/淋巴增强因子，结肠腺瘤样息肉蛋白、支架蛋白等的结合部位，C末端也是T细胞因子/淋巴增强因子的结合部位^[21]。Bain等^[22]发现，在此过程中，骨形态发生蛋白2可以上调β-链蛋白。

C3H10T1/2细胞过度表达β链蛋白或加入氯化锂使内源性p链蛋白表达上调，均能使成骨细胞早期分化标志物表达及活性增加，但对成骨细胞晚期分化标志骨钙素无明显作用。这表明此蛋白在成骨前体细胞及成骨细胞增殖分化过程中发挥作用，并受骨形态发生蛋白2的调节^[22-23]。

2.2.4 T细胞因子/淋巴增强因子 Wnt/β-连环蛋白信号通路启动后，累积的游离β-连环蛋白由胞浆进入细胞核内，β-连环蛋白一级结构中的C末端取代转录抑制因子Groucho与核内转录因子T细胞因子/淋巴增强因子结合，并与DNA形成三元复合物，改变DNA结构，活化RNA聚合酶，启动基因转录^[24]。

2.3 Wnt信号通路与成骨细胞

2.3.1 骨髓干细胞向成骨细胞分化骨髓间充质干细胞在一定的条件下可分化为软骨细胞，成骨细胞，成肌细胞等，具有多向分化性，基质干细胞的均衡分化是骨髓形成与内环境稳定的本质，具体的分化机制目前还未完全阐明。近年对Wnt信号通路的研究中发现，Wnt信号通路在骨髓间充质干细胞的增殖和分化过程中扮演重要角色^[25-26]，Si等^[27]的研究显示：Wnt信号通路中的Wnt3a可以激活富含半胱氨酸61(CCNl/Cyr61)基因，促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化。Li等^[28]的研究发现可以通过激活β-连环蛋白-T细胞因子/淋巴增强因子的基因转录，促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。Mbalaviele等^[29]研究小鼠结果显示：β-连环蛋白和骨形态发生蛋白2间存在协同作用，可以显著地上调骨钙素的基因表达，促进基质矿化及新骨形成。但Cho等^[30]的研究表明：当Wnt3a的表达量增加时，间充质干细胞向成骨方向分化受到抑制，已经进入骨生成状态的的间充质干细胞出现基质钙化减缓和碱性磷酸酶活性降低。提示Wnt信号通路在骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的不同阶段作用可能不同，在初始阶段，Wnt信号通路促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，在分化终末阶段，Wnt信号通路可能产生抑制作用。 PPAR-γ在成脂分化中被广泛关注，对成脂分化具有诱导作用，是一个配体依赖性的转录因子，脂肪酸衍生物可激活其受体，其他相关的细胞因子也参与PPAR-γ基因的调节及细胞分化^[30-31]。非经典信号通道可通过CaM KⅡ- TAK1/TAB2-NLK反向抑制PPAR-γ转录活性, 推进骨髓基质干细胞的成骨分化,抑制其向成脂分化^[32]。非经典 Wnt 配体(Wnt-5a)可通过激活NLK，形成复合抑制体，通过组蛋白H3-K9的甲基化使PPAR-γ的功能失活, 促进成骨作用^[33]。

2.3.2 成骨细胞分化研究表明，Wnt信号通路在成骨细胞的分化，增殖，迁移过程中发挥了重要作用^[34-35]，Kato等^[36]的研究发现：低密度脂蛋白受体相关蛋白5基因的敲除小鼠，脊柱骨小梁骨密度降低，2个月大时发生胫骨骨折，原因是明显骨质疏松。Glass等^[37]的实验结果显示结肠腺瘤样息肉蛋白基因敲除小鼠，细胞内β-连环蛋白水平明显增高，破骨细胞分化和活性降低因为成骨细胞骨保护素基因表达上调，破骨细胞受体受体活化因子配体表达下调。β-连环蛋白基因敲除小鼠，皮质骨松质骨骨量降低，成骨细胞分化和基质矿化减少，同时破骨细胞的分化和活性增加，出现骨质疏松。

Wnt/β-连环蛋白信号通路促进成骨细胞的增殖和分化。Redda等^[38]的研究发现β-连环蛋白促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，同时抑制其向脂肪细胞或软骨细胞分化。敲除β-连环蛋白基因的小鼠，前成骨细胞不再继续成熟分化并转向软骨细胞分化，成骨细胞增殖率降低，矿物质沉积率下降，骨量减少，而破骨细胞的增殖率升高，出现骨质疏松。

另外，研究表明Wnt信号通路促进骨形成与其抑制成骨细胞的程序性死亡有关。Akhter等^[39]研究显示低密度脂蛋白受体相关蛋白5基因功能获得型1岁小鼠，相比野生型小鼠，皮质骨厚度增加30%，总骨面积增加了4倍，矿化表面增加了40%，但小鼠骨的MAR(矿物质沉积率)并没有明显增加，提示成骨细胞的活性没有受到影响，原位末端脱氧核苷酸转移酶标记测定显示，低密度脂蛋白受体相关蛋白5基因功能获得型小鼠的骨细胞和成骨细胞程序性死亡率相比野生型小鼠明显降低，提示骨量的增加是成骨细胞和骨细胞数量增加的结果，也就是抑制了成骨细胞的程序性死亡的结果。在Bodine等^[40]的研究中分泌型卷曲相关蛋白1基因敲除小鼠股骨骨小梁体积及骨矿化密度增加，骨矿化比率也有增加，但对皮质骨没有明显变化。提示分泌型卷曲相关蛋白1在骨的改建中扮演重要角色，同时分泌型卷曲相关蛋白1基因的缺失可能激活了Wnt信号通路，从而抑制了成骨细胞与骨细胞的程序性调亡。

2.3.3 骨疾病骨质疏松是由多种原因引起的一组高发的代谢性骨病变，特点是骨组织钙化正常，钙盐与基质比例正常，而单位体积内骨组织量减少。发病率较，尤其是高老年人，并且女性患者多于男性。在导致骨质疏松的众多原因当中，Wnt/β-连环蛋白信号通路的作用越来越受到研究者的关注。Kato等^[36]的研究发中低密度脂蛋白受体相关蛋白5基因的敲除小鼠，脊柱骨小梁骨密度降低，发生胫骨骨折，原因就是明显骨质疏松，Holmen等^[41]的研究表明，β-连环蛋白基因敲除小鼠，皮质骨和松质骨的骨量都出现明显降低，并且抑制了成骨细胞的分化和基质的矿化，同时促进了破骨细胞的分化和活性，出现骨质疏松。为了进一步证明通过调控Wnt/β-连环蛋白信号通路，可以调节正常或者骨质疏松的骨量。Bennett等^[42]研究中，通过转基因技术使Wnt10b在小鼠骨髓中直接表达，减少了白色和棕色脂肪的形成，抑制了饮食导致的肥胖，增加了葡萄糖耐量，同时增加了骨量，无论性别，股骨远端干骺端骨体积分数(TBV)增加4倍，但皮质骨的性质并没有发生明显改变。提示Wnt/β-连环蛋白信号通路中的信号分子可能成为治疗骨质疏松药物的靶标，而成为药物治疗骨质疏松的手段之一。

骨关节病是一种慢性关节疾病，其主要改变是关节软骨退行性病及继发性骨质增生。按病因分为原发性和继发性，骨关节病的发生和影响因素众多，很多机制尚不明确，因此治疗研究的发展也较缓慢。Kobayashi等^[43]研究发现，β-连环蛋白基因敲除小鼠，在膜内成骨和软骨内成骨的过程中，间充质不向成骨细胞分化而是向软骨细胞方向分化。提示Wnt/β-连环蛋白信号通路中的信号分子可能是骨关节病发病机制的关键因子，也可能作为成为治疗骨关节病的靶标。

类风湿关节炎是一种累及周围关节为主的炎性关节病，是国内最常见的风湿病，其发病机制尚未完全明确。在类风湿关节炎疾病过程中骨代谢改变是其主要表现之一，也是研究的热点问题。近国内外学者发现，Wnt信号途径同类风湿关节炎引起的骨代谢改变也有着密切的联系，在类风湿关节炎患者病情发展中，Wnt信号途径通过在类风湿关节炎患者的成骨细胞、破骨细胞、成纤维细胞样滑膜细胞中发挥效应，促进骨质疏松、骨质侵蚀的发展^[44]。类风湿关节炎患者使用糖皮质激素治疗也可影响成骨细胞内的wnt信号途径。通过针对地塞米松的研究表明：①Wnt信号途径的抑制剂Dickkopf1(Dkkl)上存在糖皮质激素反应原件。应用小干扰RNA使成骨细胞内Dickkopf1的编码基因沉默后，地塞米松对成骨细胞分化发育的抑制作用消失，进一步的研究发现，在人Dickkopf1基因启动子的788-774 bD的区域存在糖皮质激素反应元件，地塞米松可显著增加Dickkopf1的表达，而对低密度脂蛋白受体相关蛋白表达的影响甚微^[45]。②地塞米松可以抑制成骨细胞中Wnt经典途径T细胞因子/淋巴增强因子的作用。其通过诱导组蛋白去乙酰基酶的表达，抑制T细胞因子/淋巴增强因子介导的促基因转录作用，影响成骨细胞分化。通过对成骨细胞荧光酶染色的方法，Smith和Frenkel发现T细胞因子/淋巴增强因子在地塞米松干预的细胞内受到抑制，而导人组蛋白去乙酰基酶的基因片段，发现地塞米松对T细胞因子/淋巴增强因子的抑制作用加强^[46]。③地塞米松还通过增强糖原合酶激酶-3β对磷酸化敏感性而激活糖原合酶激酶-3β，应用地塞米松干预成骨细胞样细胞，用蛋白印迹法可以检测到糖原合酶激酶-3β的升高，从而促进β-连环蛋白降解，影响wilt信号转导途径，抑制成骨细胞分化发育^[47]。Wnt信号途径在类风湿关节炎造成的骨代谢(骨侵蚀、骨质疏松)改变中发挥着重要作用。在类风湿关节炎患者体内Wnt信号途径主要通过成骨细胞发挥作用。其成骨细胞中Wnt信号途径的抑制因子上调，能够降低骨保护素/受体活化因子配体比值，促进破骨细胞分化成熟；此外，其成纤维细胞样滑膜细胞中Wnt信号途径上调，通过诱导细胞因子分泌，活化破骨细胞以及上调基质金属蛋白酶3加剧了骨质侵蚀，糖皮质激素对Wnt信号途径影响的研究有助于防治糖皮质激素诱导的骨质疏松，寻找更佳的类风湿关节炎治疗方案^[48]。

2.3.4 药物干预Wnt信号通路大量研究数据显示Wnt/β-连环蛋白信号通路与多种骨病有着密切联系，因此以该通路作为药物靶点，可能为治疗提供了新希望。一般可采取两种基本治疗方法，即采用激活该通路的活化子或拮抗该通路的抑制子^[49]。然而，纯化的重组Wnt蛋白非常难以获得且十分昂贵，将其作为活化子使用的治疗方案花费太大，故采用拮抗该通路抑制子的方法则更为可行^[50]。可采用特异性抗体中和分泌的wnt信号抑制子，也可利用小分子失活抑制β-连环蛋白活性的胞内酶体(如糖原合酶激酶-3β)。既然wnt信号通路在发育中占有如此重要的地位^[51]，调控其分子的潜在毒性研究也应特别考虑。靶定Wnt通路的安全性，在于该通路的激活可诱导癌症的发生。尽管迄今为止并未见报道将人类肿瘤与编码Vnt配体或受体的突变相联系，但Wnt通路中某些组分却牵涉其中，如核内β-连环蛋白是培养的角质形成细胞稳定繁殖的潜在因素^[45]。因此。长期使用糖原合酶激酶-3β抑制剂可能会增加癌变风险，亦需对发展糖原合酶激酶-3β抑制剂的安全性考验。

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